PCR (recherche) - application. Quelle est la technique PCR?

La PCR est un test qui a été utilisé dans le diagnostic de nombreuses maladies. La méthode PCR permet de montrer la présence directe de bactéries dans l'organisme, et plus précisément son ADN. Le test PCR est utilisé, entre autres dans le diagnostic de la maladie de Lyme. Quelle est la technique PCR? Qu'est-ce que la PCR en temps réel?

Table des matières:

1. PCR (test) - quelle est la technique PCR?
2. PCR (recherche) - application de la méthode PCR
3. PCR (recherche) - maladie de Lyme
4. PCR (recherche) - résultats. Peuvent-ils être des faux positifs?
5. PCR (recherche) - résultats. Peuvent-ils être faux négatifs

La PCR (réaction en chaîne par polymérase) est la méthode de base utilisée dans les laboratoires de génétique et moléculaire. Il a été développé en 1983 par Kara Mullis, qui a reçu le prix Nobel en 1993 pour cela.

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PCR (test) - quelle est la technique PCR?

Le test PCR consiste en une amplification multiple (généralement en 30 à 40 cycles) d'un fragment d'ADN spécifique, par exemple des gènes codant pour des protéines Borrelia, avec l'utilisation de l'enzyme polymérase.

Ensuite, des colorants moléculaires spéciaux sont utilisés pour rendre visible le fragment d'ADN amplifié. La PCR, due à l'amplification de fragments d'ADN spécifiques, est une méthode ultra-sensible.

Dans la méthode PCR, les fragments d'ADN sont amplifiés en utilisant des paires d'amorces spécifiques pour une région donnée de l'ADN bactérien. Par exemple, les régions cibles dans la PCR utilisées dans le diagnostic de la maladie de Lyme sont des gènes codant pour des protéines, par ex. ADNr 16S, recA, fla, p66, OspA.

Le matériel biologique à partir duquel le test peut être effectué est:

• du sang
• une section de peau d'un érythème migrateur
• liquide cérébro-spinal
• liquide synovial ou du cartilage articulaire
• urine

PCR (recherche) - application de la méthode PCR

En plus du diagnostic de la borréliose de Lyme par la méthode PCR, il est possible de détecter des fragments d'ADN spécifiques d'autres micro-organismes ou humains. Par conséquent, la méthode PCR est également utilisée dans:

• diagnostic et suivi des infections virales: herpèsvirus (herpès virus, herpès zoster, Epstein-Barr, cytomégalovirus), VIH, virus de l'hépatite (VHB et VHC)
• diagnostic et surveillance des infections bactériennes, en particulier des bactéries qui ne peuvent pas être identifiées par culture, par exemple la tuberculose
• diagnostic et suivi des maladies néoplasiques: leucémie, cancer du sein, cancer colorectal, cancer du poumon
• diagnostic de prédisposition au cancer: cancer du sein et de l'ovaire (gènes BRCA1 et BRCA2), cancer colorectal (gènes APC et CHEK2)
• diagnostic des maladies génétiques: hémochromatose (gène HFE), thalassémie (gènes HBA1 et HBA2), maladie cœliaque (gènes HLA)
• des tests de paternité, qui détectent la compatibilité ADN de l'enfant et du père

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Actuellement, il existe de nombreuses modifications à la méthode PCR. Par exemple, dans le diagnostic de la borréliose de Lyme, les méthodes de PCR nichée et de PCR en temps réel sont principalement utilisées. Cette dernière est une méthode quantitative et permet de déterminer le nombre exact de copies d'ADN de Borrelia dans le matériel biologique testé.

PCR (recherche) et maladie de Lyme

Les tests sérologiques sont à la base du diagnostic de la maladie de Lyme. Cependant, il existe des situations cliniques qui peuvent rendre ces tests faux négatifs:

• fenêtre sérologique, c'est-à-dire la période initiale d'infection au cours de laquelle l'organisme ne produit pas encore d'anticorps IgM et IgG spécifiques contre les spirochètes Borrelia
• chez les personnes immunodéprimées qui ne produisent pas suffisamment d'anticorps
• la présence de complexes immuns constitués d'antigènes de Borrelia spirochetes et d'anticorps spécifiques pour eux et empêchent la détection d'anticorps par des méthodes sérologiques

Si les symptômes de la maladie de Lyme sont suspectés chez le patient et que les résultats des tests sérologiques sont négatifs, des tests moléculaires basés sur la méthode PCR peuvent être effectués.

L'ADN des spirochètes de Borrelia peut être détecté au stade précoce de l'infection, car le nombre de spirochètes dans les fluides corporels est alors le plus élevé.

Dans le diagnostic de la borréliose de Lyme, des méthodes sérologiques telles que l'ELISA sont principalement utilisées, mais dans certaines situations cliniques, des tests génétiques utilisant la méthode PCR sont utiles.

Plus le délai entre l'infection est long, moins il y a de chances de détecter l'ADN bactérien. Par conséquent, dans certains cas, avant que le test PCR ne soit effectué, les bactéries sont cultivées sur des milieux spéciaux pendant 1 à 2 semaines, puis le test est effectué.

Cette approche est utilisée en cas de suspicion de maladie de Lyme et de prélèvement de liquide céphalo-rachidien. Dans la phase tardive de l'infection, il est plus approprié d'effectuer un test ELISA.

La méthode PCR ne doit pas être utilisée dans le diagnostic de routine de la borréliose de Lyme en raison du manque de standardisation concernant la présence des variétés de Borrelia burgdorferi en Pologne.

Cependant, en cas de difficultés de diagnostic (en particulier au stade précoce de la maladie), le résultat du test PCR facilite le processus de diagnostic.

Un résultat de test positif signifie que la présence d'ADN de Borrelia burgdorferi et de ses variétés a été détectée dans le matériel testé, mais il n'explique pas si une infection active a lieu dans le corps. En revanche, un résultat négatif n'exclut pas la présence de bactéries dans le corps.

Certains laboratoires proposent des tests pour détecter la présence d'ADN de Borrelia dans la tique. Cependant, le résultat d'un tel examen n'est pas la base du diagnostic de la maladie de Lyme chez une personne mordue.

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PCR - résultats. Peuvent-ils être des faux positifs?

La PCR est une méthode ultra-sensible et en même temps très sensible à la contamination. Par conséquent, il est très important dans les tests basés sur la PCR de sélectionner un contrôle interne approprié pour exclure les faux positifs.

La clé est également la collecte correcte de matériel pour le test ainsi que l'expérience et la fiabilité du diagnosticien effectuant le test.

PCR - résultats. Peuvent-ils être faux négatifs

Comme dans tout test de laboratoire, également dans la méthode PCR, des résultats faussement négatifs peuvent apparaître. Ici, il est crucial de collecter du sang pour un anticoagulant approprié, car certains d'entre eux, comme l'héparine, peuvent inhiber la réaction de PCR.

En outre, la collecte de matériel après le début de l'antibiothérapie peut entraîner une diminution de l'efficacité de la réaction PCR et une plus grande probabilité de résultats faussement négatifs.

Il faut également se rappeler que les bactéries Borrelia vivent très peu de temps dans le sang et les fluides corporels, car grâce à des récepteurs spéciaux, elles pénètrent très rapidement dans les endroits «difficiles à atteindre» du corps.

Par conséquent, contrairement au diagnostic d'autres micro-organismes, le nombre de spirochètes Borrelia dans le matériel biologique est faible, parfois même à la limite de détection de la méthode PCR. Cela peut également provoquer un faux négatif.

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Littérature

1. Dunaj J. et al.L'importance de la méthode PCR dans le diagnostic de la borréliose de Lyme. Feuilleter Épidémiol. 2013, 67, 119 - 123.
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A propos de l'auteur

Karolina Karabin, MD, PhD, biologiste moléculaire, diagnosticienne de laboratoire, Cambridge Diagnostics Polska Biologiste avec une spécialisation en microbiologie et diagnosticienne de laboratoire avec plus de 10 ans d'expérience en laboratoire. Diplômé de l'École de médecine moléculaire et membre de la Société polonaise de génétique humaine, responsable des bourses de recherche au Laboratoire de diagnostic moléculaire du Département d'hématologie, d'oncologie et de maladies internes de l'Université de médecine de Varsovie. Elle a défendu le titre de docteur en sciences médicales dans le domaine de la biologie médicale à la 1ère faculté de médecine de l'Université de médecine de Varsovie. Auteur de nombreux travaux scientifiques et populaires dans le domaine du diagnostic de laboratoire, de la biologie moléculaire et de la nutrition. Au quotidien, en tant que spécialiste dans le domaine du diagnostic de laboratoire, il dirige le département fonctionnel de Cambridge Diagnostics Polska et coopère avec une équipe de diététiciens de la CD Dietary Clinic. Il partage ses connaissances pratiques sur le diagnostic et la thérapie diététique des maladies avec des spécialistes lors de conférences, de formations, de magazines et de sites Web. Elle s'intéresse particulièrement à l'influence du mode de vie moderne sur les processus moléculaires du corps.